DNA含量的计算公式为:DNA含量(mg/mL)=50´(260 nm的读数)´稀释倍数。公式中50的含义是:在标准厚度为1 cm的比色杯中,OD260为1相当于50 mg/mL的双链DNA,40 mg/mL的RNA,37 mg/mL的单链DNA以及30 mg/mL的寡核苷酸,因此若是测定RNA的含量,50应该换为40。从这里也能够看出,这个公式适用的前提是PCR是成功的。PCR是否成功,可用电泳来初步鉴定。
9.专题5课题3:什么是变性胶?SDS的作用是什么?
聚丙烯酰胺凝胶根据其中是否加入变性剂而分为变性胶和非变性胶。所谓变性胶是指在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS(sodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸钠)、DTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)或尿素而制成的凝胶。SDS是一种阴离子表面活性剂,它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的构象,特殊是在有强还原剂DTT等存在的情况下,蛋白质分子内的二硫键被还原,这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合从而形成带负电的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子与SDS充分结合后,所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量,因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。此外,蛋白质-SDS复合物在水溶液中的外形类似椭圆长棒状,不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度是相近的,只是长轴长度随蛋白质分子量的大小而正比变化。这样,蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率就不再受蛋白质外形和所带电荷的影响,也就是说,此时电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。因此,SDS-PAGE变性胶是一种非常好的检测蛋白质分子量、分离蛋白质和亚基组分分析的方法。它还能使DNA和RNA变性,并使其带上同种电荷,从而正确地分离DNA和RNA。通常用于分离蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶属于变性胶。
反之,在聚丙烯酰胺凝胶中不加入SDS、DTT或尿素而法制成的凝胶属于非变性胶。非变性胶中蛋白质迁移的速率不仅取决于蛋白质的大小,还包括其电荷或者外形。此种电泳方法由于pH值影响蛋白质所带的净电荷,对pH值的变化敏感。可分离开折叠蛋白和非折叠蛋白,单体和二聚体,蛋白复合物。
